Основные принципы ГИ

Бурное развитие ГИ началось после 1970 г., когда из клеток бактерий научились выделять рестриктазы — ферменты, защищающие бактерии от бактериофагов. Узнавая в чужеродной ДНК специфичный для каждой рестриктазы сайт (последовательность из 4—6 нуклеотидов), рестриктазы делают в этом сайте разрывы обеих цепей ДНК. В результате чужеродная ДНК оказывается разрезанной на фрагменты и нефункциональной. На сегодня известно около 3500 рестриктаз. Например, рестриктаза Eco RI ("еко-эр-один") из кишечной палочки (Escherichia coli) узнает сайт ГААТТЦ:

В результате ступенчатого разреза образуются фрагменты ДНК с выступающими однонитевыми концами, комплементарными друг другу. Эти концы могут вновь соединяться, поэтому их называют "липкими концами". Если взять ДНК, например, человека и моркови, обработать одной и той же рестриктазой и смешать, то фрагменты ДНК моркови и человека будут соединяться липкими концами. Но такая связь будет непрочной: водородные связи между всего лишь четырьмя парами оснований могут легко разойтись. Слипшиеся фрагменты ДНК можно зафиксировать, если добавить в раствор ДНК-лигазу (второй по значимости фермент ГИ), сшивающую цепи ДНК, разрезанные рестриктазой. В результате получится стабильная рекомбинантная ДНК.

Далее необходимо сохранить и размножить полученные рекомбинантные молекулы. С этой целью их встраивают в специальные конструкции, называемые векторными молекулами ДНК, или векторами. Обычно векторы конструируют из бактериальных плазмид. Типичный вектор включает:

1. Сайт узнавания определенной рестриктазой для встраивания в вектор целевой ДНК.

2. Ген устойчивости к одному из антибиотиков для последующего отбора клеток, получивших рекомбинантный вектор.

3. Промотор, обеспечивающий экспрессию целевой ДНК.

Приведем пример использования вектора для получения штамма кишечной палочки, продуцирующей целевой белок. Для встраивания в вектор смесь фрагментов целевой ДНК (с геном, кодирующим целевой белок) и ДНК вектора обрабатывают сначала одной и той же рестриктазой, затем ДНК-лигазой. В результате образуется рекомбинантный вектор. Для размножения его вводят в клетки кишечной палочки или дрожжей. На поверхности твердой питательной среды с антибиотиком каждая клетка, несущая рекомбинантный вектор, размножается и образует колонию из одинаковых клеток — клон. Каждая клетка-родоначальница клона получила одну молекулу рекомбинантного вектора, которая реплицируется и передается всем клеткам колонии. Поэтому такую процедуру называют молекулярным клонированием.

Первой реакцией научной общественности на создание ГИ-технологии было введение ограничений на эксперименты с рекомбинантными ДНК. Ученые полагали, что объединение генов разных организмов может привести к появлению нового организма с нежелательными или даже опасными свойствами. Прошло несколько лет, и исследователи убедились, что их опасения сильно преувеличены. Микроорганизмы, измененные с помощью генно-инженерных манипуляций, во внешней среде не выдерживают конкуренции, поскольку значительную часть своих ресурсов они затрачивают на синтез целевого белка, в ущерб собственной конкурентоспособности.


Социальное поведение
Насекомые в основном «индивидуалисты», но для определенного числа видов свойственно врожденное социальное (внутривидовое и межвидовое) поведение. Оно характеризуется такими проявлениями, ка ...

Утки
Почему у птиц не мерзнут ноги? Вам, вероятно, не раз случалось наблюдать, как на замерзшем озере вокруг полыньи бодро толпятся утки. И хотя птицы проводят на льду или в холодной воде большу ...

Земноводные. Социальный поведенческий комплекс
Существует еще один вид сложного поведения животных – это социальное (внутривидовое и межвидовое) поведение. Несмотря на то, что земноводным в основном свойственен «индивидуализм», для опре ...